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10%中性福尔马林组织固定液

免疫组化技术的关键问题—固定

文章出处:中山市康乃欣生物医疗科技有限公司责任编辑:W.作者:W.人气:-发表时间:2014-09-25 17:26:00【

  固定是技术室工作的第一步,也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”,就是组织离体后,用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败,防止了细胞内的酶对蛋白质的分解作用,使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物或酶类转变为不溶性物质,以保持原有的结构与生活时相仿。另外,组织固定后,均呈一定的硬化状态,增加组织韧性,而且不易变形,有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必需及时固定,固定液的量应为组织的4倍。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。

  对于固定液的选择,原则上讲,应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液,但除非是专项科研项目,在病理常规工作很难做到这一点,因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色,而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性福尔马林固定液或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定,利用其渗透性强,对组织的作用均匀进行固定,但组织固定时间最好在l2h内,一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。

  1)4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.3):该固定液适用于免疫组织化学方法。动物先用此液进行灌注固定,取材后,再用该液浸泡固定2-24h。

  固定液配方1:40g多聚甲醛,溶于1000ml,0.1mol/L的PB液,不容易溶解,放于密封瓶中,60℃温箱过夜即可溶解,也可以加温至60℃,搅拌溶解。

  固定液配方2:多聚甲醛40g,PBS0.1mol/LPH7.4500ml,混合后加热至60℃,搅拌并滴加1NNaOH至清亮为止,冷却后加PBS至总量1000ml。注固定时间24小时。

  2)4%多聚甲醛-磷酸二钠/氢氧化钠液:该固定液适用于光镜和电镜免疫组织化学方法。用于免疫电镜标本时,应加入新鲜配制的戊二醛,使其终浓度为0.5-1%。此固定液性质温和,可长期保存组织。

  固定液配方:甲液-多聚甲醛40g,蒸馏水400ml;乙液-NaH2PO42H2O16.88g,蒸馏水300ml;丙液-NaOH3.86g,蒸馏水200ml。先将甲液中多聚甲完全溶解,乙液倒入丙液混合后倒入甲液,用1mol/LNaOH或1mol/LHCL将pH调至7.2-7.4。补充蒸馏水至1000ml,充分混合后,4℃保存。

  3)中性福尔马林固定液:对大多数抗原保存较好,是免疫组织化学最常用的固定液,组织穿透性好,组织收缩小。最常用的固定液,能满足常规HE及免疫组化、PCR等工作。一般无特殊要求的病理标本均适用。尤其值得注意的是,中性福尔马林是以pH7.2~7.4的磷酸缓冲液为溶剂配制的,其固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般的4%福尔马林固定液。此固定液配制后应密封并保存在阴凉处,保存时间固定时间以24h以内为宜,不要超过一个月。

  固定液配方1:40%中性福尔马林10ml,0.01mol/LpH7.4的PBS90ml。

  固定液配方2:40%中性福尔马林120ml,蒸馏水880ml,磷酸二氢钠(NaH2PO4?H2O)4g,磷酸氢二钠(Na2HPO4)13g。

  固定液配方3:中性福尔马林(40%)100ml,无水磷酸氢二钠6.5g,磷酸二氢钠4.0g,蒸馏水900ml。

  固定液配方3:10%中性福尔马林固定液1000ml,Na2HPO412H2O16.3g,NaH2PO42H2O4.5g,福尔马林100ml。

  3、样品的:

  组织标本固定于4%多聚甲醛中,4℃过夜后,移入PH7.4,0.O1MPBS,4℃过夜,换液1次,置低温冰箱-40℃冷藏保存待测。

  4、样品的渗透和包埋:

  注入30%蔗糖4℃渗透至组织沉底,用包埋剂包埋,切片。

  5、切片的保存:可放在-20℃冷藏保存待测。

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